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之前我們介紹了 " 永生 DNA 鏈假說 "，這是一個非常 " 聰明 " 的減少癌癥發生率的方法，可以說保護著我們中的大多數人免得癌癥。

在科學探索的歷程中，哪些實驗驗證了這個假說？

非隨機才是常態

為了證明干細胞能夠保留永生的 DNA 鏈，Cairns 與 Christopher Potten （1940-2012）合作，用 3H 胸腺嘧啶標記小鼠小腸干細胞形成時的 DNA，4 周后觀察這些具有放射性的 DNA 分布情況。結果發現，隨著細胞分裂次數的增加，具有放射性的 DNA 由于隨機分配而不斷 " 稀釋 "，導致放射性強度降低。

但是在隱窩（crepts，小腸絨毛之間的凹陷處）深處，從底部往上算起第 4 位上的細胞放射性強度很高，與 DNA 剛被標記時相當。這里正好是小腸干細胞所在的位置，所以很可能是小腸干細胞在一直保留被標記的 DNA 鏈。用同樣的方法， Cairns 與 Potten 在舌頭味蕾基部（也是干細胞所在的位置）發現了少數保留放射性 DNA 的細胞。這些結果也都支持了永生 DNA 鏈的假說。

小腸隱窩縱切片示意圖，從下往上數第四個細胞即為小腸干細胞

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其他科學家對動物、植物、真菌進行了多次觀測，并證實了 Cairns 的觀察結果。在這些研究中，細胞都能長時間保留標記的 DNA 鏈，因而被稱之為 " 標記保留細胞 "（Label retaining cells, LRCs）。它們在數量上遠少于組織中的其他細胞，而這正是干細胞在各種組織中數量的特點，其位置也符合用其它方法發現的干細胞的位置，與 Cairns 關于干細胞能夠選擇性地保留永生的 DNA 鏈的理論相符。這些實驗說明DNA 鏈的非隨機分配是一個在生物界中普遍存在的現象。

但是這些結果還不能證明這些細胞就是干細胞。如果在被標記之后有少數細胞出于某種原因不再分裂，這些細胞也能夠長期保留被標記的 DNA 鏈。而干細胞的任務是替補老化和受損的體細胞，是必須進行分裂的，如果能夠證明這些保留標記 DNA 鏈的細胞也在不斷分裂，那就可以為這些細胞是干細胞的結論提供更有說服力的證據。

雙標記法證明標記保留細胞確實在分裂

2002 年，為了證明小腸絨毛中標記保留細胞確實在分裂，除了用 3H 胸腺嘧啶標記 DNA 鏈外，Potten 還用 BrdU（溴代脫氧尿苷）標記以含 3H 的 DNA 鏈（爺爺輩的）為模板合成的 DNA 鏈（父親輩的）。在 BrdU 標記后的第一天，90% 以上的小腸絨毛隱窩第 4 位的細胞都被 3H 和 BrdU 同時標記，說明這些細胞在被 3H 標記后進行過細胞分裂（這樣 BrdU 才能組入新合成的 DNA 鏈）。

在往后的日子中，第 4 位的細胞一直保留 3H 標記，而 BrdU 的信號卻逐漸下降，到第 8 天時信號強度只余下 3%。如果第 4 位的細胞不分裂，3H 和 BrdU 的信號都應該一道被保留，而如果細胞分裂時 DNA 的分配是隨機的，3H 的信號和 BrdU 的信號都應該同時被稀釋而不斷降低。實際觀察結果說明，這些細胞在不斷地進行不對稱分裂。繼續作為干細胞的子細胞保留了被 3H 標記的、輩分較高的 DNA 鏈，而被 BrdU 標記的父親輩 DNA 鏈則被分配到要進行分化的子細胞中去，在其后的對稱分裂中逐漸被稀釋。這是對小腸干細胞進行不對稱分裂，選擇性地保留 DNA 鏈原件最強有力的證據。

此后，科學家們進行了更多次雙標記法標記細胞的實驗，均表明動物組織中那少數保留 DNA 鏈原件的細胞確實在不斷地進行分裂，進一步支持了這些細胞是干細胞的想法。

用 BrdU 標記的人體心臟細胞 DNA 鏈所觀測到的 DNA 隨機分離（A）與非隨機分離（B）現象

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不過這些實驗還沒有完全證明保留 DNA 鏈原件的細胞真的具有干細胞的特征，而繼承輩分低的 DNA 鏈的細胞真的是要進行分化的細胞。隨著干細胞研究的進展，這個問題也被解決了。

保留 DNA 鏈原件的細胞具有干細胞的特征

2007 年，美國斯坦福大學的 Thomas Rando 用氯代脫氧尿苷（CIdU）和碘代脫氧尿苷（IdU）來標記小鼠的肌肉干細胞。干細胞原本的 DNA 是爺爺輩的，不進行標記；其第一輪分裂時形成的 DNA 為父親輩的，用 CIdU 標記；第二輪分裂時的 DNA 為兒子輩的，用 IdU 標記。標記后的細胞被分開為單個細胞培養，讓細胞完成第二輪分裂。

為了更好地追蹤細胞第二輪分裂的情形，Rando 在培養基中加入了細胞松弛素（cytochalasin D）。細胞松弛素不影響細胞核的分裂，但能使分裂形成的兩個子細胞不會完全分開，而是形成細胞對，這樣就可以確保這兩個細胞是來自同一個干細胞。染色結果表明，所有的子細胞都含有 IdU 的染色，但是 CIdU 染色只集中在其中的一個子細胞中。由于 CIdU 標記的是父親輩的 DNA 鏈，不顯示 CIdU 染色的細胞應該就是爺爺輩的 DNA 鏈。那么是哪一個子細胞仍然保留干細胞的特性，哪一個子細胞會進行細胞分化呢？

在這里，Rando 利用 " 肌間線蛋白 "（Desmin）來區分兩個子細胞。由于要分化為肌肉細胞的那個子細胞會表達肌間線蛋白，而繼續保留為干細胞的那個子細胞不會表達肌間線蛋白，看看肌間線蛋白在哪個子細胞中表達，就可以知道哪一個是干細胞，哪一個是要分化的細胞了。

實驗結果表明，繼承 CIdU 標記的子細胞表達肌間線蛋白，而不繼承 CIdU 的 " 子 " 細胞不表達 Desmin，這就清楚地表明繼承爺爺輩 DNA 鏈的子細胞繼續為干細胞，而繼承父親輩 DNA 鏈的子細胞是要進行分化的細胞。

與這一實驗差不多同時期，其他科學家又進行了多次類似實驗，結果均表明動物組織中的確存在少數不斷進行分裂，而又能保留 DNA 鏈原件的細胞，而且這些細胞還表達干細胞的標記物，或者不表達要分化細胞的標記物（如上述實驗中的肌間線蛋白），證明這些細胞確實是干細胞。Cairns 在 1975 年提出的干細胞保留永生 DNA 鏈的理論，也得到了充分的證明。

毛囊干細胞 DNA 隨機分離（左）和非隨機分離（右），其中 DAPI、CyA、Lgr5 等均為蛋白質類型，它們都是證明細胞處于不斷分裂中的標記物

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干細胞是如何保留 DNA 原件的？

在真核細胞中，DNA 被復制時誤差率極低，每個堿基對改變的幾率大約只有億分之一，因此新合成的 DNA 鏈在序列上與原件的相同程度超過 99.999999%。例如小鼠有兩份 DNA，每份 DNA 有大約 25 億堿基對，每次細胞分裂造成的序列變化不過幾十個堿基對。小鼠的每份 DNA 被分為 20 條，每條序列的改變就平均只有幾個堿基對，小鼠的干細胞是很難從這么小的差別來判斷 DNA 的輩分的。此外，在新合成的 DNA 鏈中，序列改變的位置和情形還是隨機的，細胞根本無法預測序列的改變位置和情形，也就無法根據這少量序列的差別來識別 DNA 原件。

不過，細胞可以通過表觀遺傳修飾來分辨其中 DNA 的輩分。真核細胞中的 DNA 并不是僅有堿基對，而是和組蛋白（histones）結合，組成 " 染色質 "（chromatid）。組蛋白聚合成許多小球，DNA 纏繞于其上。細胞分裂時，染色質高度濃縮，才成為在顯微鏡下容易看到的 " 染色體 "（chromosome）。所以我們在前面談到的細胞分裂時 DNA 的分配，其實是分裂期染色體的分配，分配的不僅是 DNA，還有與之結合的組蛋白及其修飾狀態。

DNA 的結構，圖中小球即為組蛋白，纏繞在組蛋白上的線狀物為堿基對，二者平時如同圖片右下角一樣，為 " 散裝 " 毛團狀，只是到了細胞分裂時才會聚合在一起形成我們印象中的短棒狀 "X" 形染色體

圖片來源：wikipedia

組蛋白的修飾方式有多種，包括乙酰化、甲基化和磷酸化。簡而言之，就是在組蛋白的氨基酸側鏈上加上不同的基團，比如乙酰化是加上乙酰基（CH3CHO-）、甲基化是加上甲基（-CH3）、磷酸化是加上磷酸根等等。不同的基團，其功效不同，讓 DNA 啟動、停止，或是合成不同的蛋白質——也就是說，這些修飾不改變 DNA 的序列，卻影響基因的表達狀況，這就是 " 表觀遺傳修飾 " （epigenetic modifications）。

不同輩分的 DNA 表觀遺傳修飾的狀況不同，就可以成為細胞識別輩分的機制。這有些像人身上穿的衣服。模板 DNA 和新合成的 DNA 就像雙胞胎兄弟，彼此極為相似。如果它們再穿同樣的衣服（組蛋白），他們之間的差別就極小，幾乎無法辨別。但是如果在雙胞胎兄弟穿的衣服上做出改變，例如配戴上不同的徽章，就容易區分他們了。組蛋白的修飾就相當于是在衣服上佩戴各種徽章，細胞也就可以識別它們了。

要選擇性地分配 DNA（染色體），除了要區分染色體的差別，還要區分紡錘體中的兩個中心粒。這樣輩分高的 DNA 才 " 知道 " 與哪個中心粒相連，從而進入特定的子細胞。實際的情形也的確如此：細胞分裂時，每個子細胞只接收 1 個中心粒，在下一次細胞分裂前，這個中心粒進行復制，形成兩個中心粒，所以兩個中心粒的輩分不同，它們所結合蛋白質（例如 Ninein 和 Cenexin）的情形也不同，這樣不同的中心粒就可以和不同輩分的染色體相互識別，并分別進入命運不同的子細胞中。

Cairns 當初提出永生 DNA 鏈的理論時，考慮的主要是 DNA 序列改變與癌癥發生率之間的關系，但是隨后的科學研究結果表明，干細胞選擇性保留的，并不只是 DNA 序列的 " 原始文件 "，還包括與高輩分 DNA 鏈相聯系的組蛋白的表觀遺傳修飾。它們共同決定了子細胞是繼續保持為干細胞還是分化為體細胞。

結語

我們的身體每天要進行大約 2 萬億次細胞分裂。盡管有這么多次的細胞分裂，但是多數人在一生中并不會得癌癥，其中一個重要的原因就是干細胞有保留 DNA 原件的本事。

當然這個機制也不能保證我們完全不得癌癥。干細胞除了進行不對稱分裂，有時也會進行對稱分裂，即兩個子細胞都是干細胞，以便在需要時增加干細胞的數量，或者在干細胞受損的情況下恢復干細胞的數量。在對稱分裂過程中，低輩份的、帶有序列變化的 DNA 鏈就會被保留在一部分干細胞中，因此不是所有的干細胞都能夠永遠保留 DNA 的原件。

而且除了細胞分裂導致的 DNA 序列變化，身體內部（例如活性氧）和外部（例如紫外線和環境污染）的因素也能夠破壞 DNA，造成干細胞 DNA 的序列變化，這是一部分人仍然會得癌癥的原因。

但是干細胞保留 DNA 原件的機制，仍然在保護著我們中的大多數人免得癌癥，我們也應該感謝生物演化過程創造出來的這個奇跡。